Der Pipettierhelfer accu-jet® S von BRAND macht die Arbeit einfach, unkompliziert und effizient. mehr

(06.09.2022) Vernachlässigt, unbeliebt und trotzdem allgegenwärtig: Zellkulturen, die gar nicht die Zellen enthalten, die sie sollen. Auch nach Jahrzehnten der Aufklärung besteht diese Problematik noch immer. Warum?

Natürlich kontrollieren Sie die Qualität Ihrer Laborwerkzeuge. Sie sequenzieren Plasmide, überprüfen Restriktionsenzyme, validieren neue E.-coli-Expressionsstämme, kalibrieren Fluoreszenz-Assays ... Verfahren Sie mit Ihren Zelllinien ebenso rigoros? Schließlich ist es offensichtlich: Magenkrebs an Riechzellen zu untersuchen, ist ebenso unsinnig wie Alzheimer-Medikamente mittels Hautgewebe zu entwickeln. Haben Sie jemals überprüft, ob Ihre käuflich erworbenen oder von Kollegen erhaltenen Zelllinien wirklich halten – und vor allem enthalten –, was die Etiketten auf den Kryoröhrchen versprechen?

Tatsächlich ist ein erheblicher Teil aller kontinuierlichen Zelllinien falsch identifiziert beziehungsweise deklariert oder mit anderen Zellen kreuzkontaminiert. Manchmal ist der Zelltyp, mit dem Forschende zu arbeiten glauben, komplett abwesend. Eine Analyse von 848 Lymphom-Zelllinien, die die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig zwischen 1990 und 2014 von 290 Laboren aus 23 Ländern erhalten hatte, offenbarte ein ernüchterndes Ergebnis: Stammten die Zellen von Biobanken oder Laboren, die sie erstmals kultiviert hatten, entsprachen früher 15 Prozent, später noch sechs Prozent der Zelllinien nicht dem, was auf der Beschriftung angegeben war. Stammten die Zelllinien von Dritten, fanden sich in 14 bis 18 Prozent aller Proben durchweg andere als die erwarteten Zellen (Int. J. Cancer. 140(5): 1209-14). Eine Meta-Analyse von dreizehn Untersuchungen aus den Jahren 1999 bis 2017 fand sogar noch höhere Häufigkeiten: 815 von 3.630 Zellkulturproben (22,5 Prozent) waren mit falschen Zellen kontaminiert (Adv. Mol. Pathol. 1(1): 209-228.e36).

Die Experten der American Type Culture Collection schätzen, dass zwei von neun Zellkulturen falsch identifiziert sind. Illustration: ATCC

Phosphor ist eine wichtige Basis für Düngemittel - Analysieren Sie Rückgewinnungspotenziale aus Klärschlamm. mehr

Die Konsequenzen dieser Schlamperei betreffen auch Forschende, die gar nicht zellbiologisch arbeiten. KB-Zellen gelten zum Beispiel als benutzerfreundliches Modell für Epidermis-Karzinome, obwohl sie von HeLa-Zellen, also malignem Gewebe des Gebärmutterhalses, abstammen – was seit 1967 erwiesen ist. Neun von zehn Autoren, die KB-Zellen zitieren, wissen das nicht (Cancer Res, 77(11): 2784-8). Und WISH-Zellen entstammen nicht dem Fruchtblasen-Epithel, sondern sind ebenfalls HeLa-Zellen. Dennoch wurden sie bei der In-vitro-Fertilisation als Nährzellen für menschliche Zygoten verwendet, aus denen sich 111 Kinder entwickelten (Reprod. Biomed. Online.16(6): 869-74).

Das Ausmaß derart „kontaminierter“ Literatur schätzten niederländische Wissenschaftler 2017 ab. In der Zitationsdatenbank Web of Science fanden sie 32.755 Artikel, in deren Titel bereits falsche Zelllinien auftauchten und die ihrerseits von 500.000 weiteren Artikeln zitiert wurden (PLoS One 12(10): e0186281). Bei acht Millionen Zellbiologie-Artikeln im Web of Science wären somit ein halbes Prozent der Primärliteratur und sechs Prozent der Sekundärliteratur „kontaminiert“. Wie viele der darin enthaltenen Daten müssen wohl neu interpretiert werden, weil mit ganz anderen als den gedachten Zelllinien experimentiert wurde?

Der mögliche Schaden für die Forschung lässt sich nur erahnen: So dienten allein die 1967 als HeLa entlarvten Zelllinien HEp2 und Intestine 407 in 8.497 beziehungsweise 1.397 Publikationen als Modelle für Larynxkarzinome beziehungsweise gesunde Darmzellen (SLAS Discov. 26(10): 1268-79). Mit Labor- und Personalkosten von 100.000 Euro pro Forschungsprojekt gingen diese Artikel mit Forschungsausgaben von einer Milliarde Euro einher. Das Register des Internationalen Komitees zur Authentifizierung von Zelllinien (ICLAC) verzeichnet gegenwärtig 531 falsche und 45 teilweise kontaminierte Zelllinien.

Dank dieser Meta-Analysen sollte das Problem falscher Zelllinienmodelle also weitgehend bekannt sein. Auch Laborjournal und Lab Times widmeten ihm 2007, 2008, 2010 und 2013 umfangreiche Artikel. Dennoch zeichnet auch die jüngste Analyse noch immer ein kritikwürdiges Bild: Als Editorial Assistant beim International Journal of Cancer (IJC) wertete Nicole Y. Souren gemeinsam mit Kollegen zwischen Juli 2018 und Juni 2021 die 747 zum Peer-Review angenommenen Manuskripte aus, deren Forschung auf 4.138 humanen Zelllinien beruhte. Unter ihnen fand sie 216 falsch identifizierte Zelllinien (EMBO J. 41(14): e11130). Ist diese Bestandsaufnahme repräsentativ für andere Journale? Dann wären noch immer fünf Prozent aller Angaben zu Zellkulturen unzuverlässig. Sind diese Fehler kleine Ungereimtheiten, die im Peer-Review-Gutachten höchstens in der Kategorie „Minor Issues“ auftauchen? In 35 der 747 Manuskripte, also fünf Prozent der Fälle, erachteten die Gutachter die Zellirrtümer für so erheblich, dass sie die Manuskripte abwiesen.

Noch etwas fiel auf: Ein Viertel der 747 Autorengruppen konnte keinerlei Authentifizierungsdokumente für ihre Zelllinien vorlegen, obwohl sie beim IJC obligatorisch und klar in den Autorenrichtlinien beschrieben sind. Selbst zum Zeitpunkt der Manuskript-Einreichung hatten sich die Autoren also noch nicht mit dieser Problematik auseinandergesetzt. Das scheint auch unnötig. Denn die Ablehnungsschreiben des IJC thematisierten zwar falsche Zellidentitäten, andere Journale veröffentlichten aber drei Viertel dieser Manuskripte – ohne dass die Autoren ihre Zellinformationen ausgebessert hätten.

Sowohl Forschungstreibende als auch Wissenschaftsverlage nehmen die Konsequenzen falsch identifizierter Zelllinien für die eigene Forschung also weiterhin in Kauf. Jahrzehntelange Aufklärungsarbeit hat sich als unzureichend erwiesen. Unwahrscheinlich, dass der vorliegende Laborjournal -Artikel daran etwas ändern wird. Aber vielleicht höhlt der stete Tropfen doch auch diesen Stein.

Der restliche Artikel beantwortet Ihnen deshalb die drei Fragen: Was sind die Ursachen für falsch deklarierte Zelllinien? Wie authentifizieren Sie Zellen? Welchen Beitrag können Wissenschaftsverlage und Forschungsförderer leisten?

In den Augen von Hans Drexler, bis 2019 Leiter der Abteilung für menschliche und tierische Zelllinien der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), entspringen Zellirrtümer der Mentalität von Forschungstreibenden: „Die meisten Forschenden erachten Zellen als Freeware oder Shareware. Sie geben sie sorglos von Labor zu Labor weiter. Dabei ist das illegal, denn jede Zelllinie gehört jemandem – meist Forschungsinstituten oder Zelllinienbanken. Für jede Zelllinie hat jemand am Anfang mal ein Material Transfer Agreement unterzeichnet – und dann gebrochen. Und genau dieses unkontrollierte Weitergeben unter der Hand bringt die ganzen Probleme mit sich. Bezögen Forscher ihre Zelllinien nur aus sicheren Quellen wie Zelllinienbanken, wäre das Problem gelöst.“

Eine weitere Ursache für Zellirrtümer hängt mit dem zusammen, was Zellkulturen wissenschaftlich so wertvoll macht – ihr unbändiges Wachstum. Unter den 576 Einträgen im Register des Internationalen Komitees zur Authentifizierung von Zelllinien sind 25 Prozent HeLa-Zellen (iclac.org/databases/cross-contaminations/). Auch in Sourens Analyse beim International Journal of Cancer handelte es sich in der Hälfte der 216 Fälle um HeLa-Zellen. „Das verwundert angesichts des aggressiven Wachstums der unsterblichen Krebszellen nicht”, sagt Christoph Plass, seit 2019 IJC-Editor-in-Chief und Seniorautor der EMBO-Journal-Analyse: „Eine rasch wachsende Zelllinie selektioniert schnell gegen eine langsam wachsende.” Infolge ihrer geringen Verdopplungszeit kann eine einzige HeLa-Zelle, die als Verunreinigung eingebracht wird, eine Zellkultur je nach Wachstumsbedingungen binnen weniger Passagen überwachsen. „Meist geschieht das unbemerkt und über Labor- und Arbeitsgruppengrenzen hinweg“, ergänzt Plass.

Dabei lassen sich Kreuzkontaminationen durch einfache Regeln vermeiden. Hexenwerk ist keine davon: Nie arbeitet mehr als eine Person unter der Sicherheitswerkbank. Nie werden mehrere Zellkulturen gleichzeitig passagiert oder die schnell wachsende vor der sich langsam teilenden Zelllinie. Alle Mitarbeitenden verwenden eigene Medien sowie Wachstumsfaktoren für jede Zelllinie, passagieren Zellkulturen regelmäßig bei nicht zu geringen Zelldichten maximal zehn- bis zwanzigmal und bewahren Aliquots der Ausgangskultur in flüssigem Stickstoff für Gütekontrollen auf.

Die entscheidende Stellschraube bringt der ehemalige Zelllinienbank-Leiter Drexler auf den Punkt: „Sämtliche Mitarbeiter werden in guter Zellkulturpraxis geschult, und zwar nicht in Online-Kursen oder indem sie irgendwem für eine halbe Stunde über die Schulter schauen, sondern in regelmäßigen Fortbildungsveranstaltungen, in denen sie sich bestimmte Verhaltensmuster aneignen. Schließlich sind es die oft als selbstverständlich erachteten Alltagsfähigkeiten im Labor, wie etwa die Handhabung von Pipetten, die über Zellkontaminationen entscheiden.“ Schulungsmaterial für eigene Präsenzkurse in Zellhygiene bietet die ICLAC-Website kostenlos an (iclac.org/education/).

„Ebenso wichtig ist es, die Identität von Zellen im Laufe eines Projekts immer wieder zu überprüfen”, sagt IJC-Chefredakteur Christoph Plass, der in Heidelberg die Abteilung Epigenomik des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ) leitet. Als Vergleichsstandard für die Zellauthentifizierung am geeignetsten sind Short-Tandem-Repeat(STR)-Profile. STRs befinden sich an spezifischen, hochpolymorphen Genomloci und enthalten bis zu hundertfach wiederholte, nichtcodierende DNA-Schnipsel von zwei bis dreizehn Basenpaaren Länge. Da je nach Lokus bis zu 100 unterschiedliche Allele bekannt sind, liefern sie für jedes humane Genom individuelle Fingerabdrücke.

Nicht drin, was draufsteht? Das sollten Forschende schon am Projektanfang klären und die verwendeten Zellen gründlich authentifizieren. Foto: Unsplash/CDC

STR-Profile können zusammen mit der Zelllinie von Biobanken wie der DSMZ, der European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) oder der American Type Culture Collection (ATCC) erworben werden. Alternativ können sie nach Antibiotika-freiem Wachstum der Zellen auch selbst erstellt werden. Dazu müssen ausgewählte STR-Loci per Multiplex-PCR amplifiziert, elektrophoretisch aufgetrennt und aus ihrer Größe die Anzahl an Sequenzwiederholungen bestimmt werden. Zur Genotypisierung stellen kommerzielle Anbieter wie die ATCC standardisierte STR-Kits zur Verfügung, die 15 bis 30 Loci testen. Oft existiert auch hauseigene Expertise in Form zentraler Serviceeinrichtungen, um uneindeutige STR-Profile etwa von Hybridzelllinien, genetisch manipulierten Zellen oder Zellmischungen zu interpretieren. Wem eine solche Genotyp-Analyse zu zeitintensiv ist, kann eine Zellprobe zusammen mit 200 Euro auch ans DSMZ in Braunschweig schicken.

Anhand eines Vergleichs mit früheren STR-Profilen, etwa der ursprünglichen Gewebebiopsie oder der Blutgenotypisierung des Spenders, lassen sich dann neben der Zellidentität auch Kontaminationen zuverlässig auffinden. Seit 2019 bietet die Referenzdatenbank Cellosaurus dafür ein Suchinstrument namens CLASTR an. Mit ihm können aktuell 139.592 Zelllinien durchsucht werden – von Menschen über Wale bis hin zu Kopffüßern und Insekten sowie patentierte, von gefährdeten Arten stammende und Weltraum-erprobte Linien (web.expasy.org/cellosaurus-str-search).

Auch ohne STR-Profil lässt sich Cellosaurus anhand des Namens einer Zelllinie übrigens auf Ungereimtheiten und Eignung fürs eigene Projekt abklopfen. Ebenso bieten ICLAC, DSMZ und ATCC eigene Suchmasken und Vergleichswerkzeuge an. Ähnlichkeiten zwischen STR-Profilen gewichten sie meist mit dem Tanabe-Algorithmus, der das Verhältnis übereinstimmender und insgesamt an den untersuchten STR-Loci bekannter Allele als Prozentwert ausdrückt (Int. J. Cancer. 132(11): 2510-9). Stimmen mehr als 80 Prozent überein, stammen die STR-Profile vom gleichen Spender.

Neben der STR-basierten Genotypisierung können Zelllinien und Gewebe auch anhand ihres Karyotyps oder über Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) authentifiziert werden. Bei Ersterem gibt die Anzahl und Morphologie mit Giemsa-Lösung oder Quinacrin gefärbter Banden von Metaphase-Chromosomen Aufschluss über die Zellidentität. Komplexe chromosomale Abweichungen lassen sich mit einer Multiplex-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (M-FISH) identifizieren. Auch für die SNP-Genotypisierung stehen mehrere Techniken zur Verfügung: Sanger-Sequenzierungen, hochaufgelöste Schmelzpunktanalysen und Single-Base-Extension(SBE)-Assays von PCR-Amplikons. Next-Generation-Sequencing erlaubt es sogar, STR- und SNP-Loci gleichzeitig auf DNA- oder RNA-Ebene zu analysieren. Mithilfe einer CRISPR-Cas-9-basierten Fragmentierung genomischer DNA können 2.000 STR-Loci nebst benachbarter SNPs auch ohne PCR-Amplifizierung sequenziert werden (Nat. Commun. 8: 14291). Eine öffentliche SNP-Datenbank mit 907 Zelllinien existiert zwar, kann aber noch nicht mit Web-Tools durchsucht werden (PLoS One 10(2): e0116218). Die Heidelberger Firma Multiplexion bietet eine SNP-Genotypisierung anhand ihrer internen Datenbank von 932 Zelllinien binnen zehn Arbeitstagen an.

Eine Reihe von Zellparametern eignet sich dagegen nicht zur Authentifizierung. Dazu zählen Änderungen in der Zellmorphologie, in Enzymaktivitäten und in den Expressions-Leveln von mRNAs und Oberflächenproteinen. Sie können nur als Warnzeichen dienen. Schließlich beeinflussen auch die Inhaltsstoffe von Nährmedien, eine Infektion mit Mykoplasmen und selbst die Zelldichte sowohl Genexpression als auch metabolische Reaktionen. Anhand ihres Phänotyps lässt sich vielleicht der Gewebeursprung einer Zelllinie validieren und ihr Zelltyp identifizieren. „Doch nur ein DNA-Fingerprinting beweist die Zellidentität und damit die Eignung einer Zelllinie als Modell für eine bestimmte Fragestellung”, hält Drexler fest und schiebt direkt hinterher: „Eine Genotypisierung darf allerdings nicht erst am Ende des Forschungsprojekts stattfinden, wenn der Promovierende den Teufel tun wird, die Doktorarbeit aufs Spiel zu setzen. Sie muss am Projektanfang erfolgen und wann immer Zellen transfiziert oder mittels einer Antibiotikaresistenz selektiert werden. Ändert sich der Phänotyp der Zellen – vor allem ihr Wachstumsverhalten – ist ebenfalls eine Authentifizierung angebracht.”

Obwohl es heutzutage also so einfach ist wie nie, Zelllinien zu überprüfen, riskieren Forschende noch immer lieber Monate ihrer Arbeitsleistung. Warum? „Weil sie Zellauthentifizierung eher als administrative Bürde und nicht als Hilfestellung in ihrem ureigenen Forscherinteresse begreifen”, meint Drexler. „Bewusstsein für diese Problematik zu wecken“, ist deshalb auch Plass‘ Hauptanliegen. „Stellt sich ein Projekt im Nachhinein als wertlos heraus, gewinnt schließlich niemand.”

Manche Forschungsförderer haben das erkannt und fordern eine Zellauthentifizierung ein. Beispielsweise erklären die US National Institutes of Health seit Herbst 2015 in ihren Förderrichtlinien: „Basing one‘s proposed research on previous publications that lacked [...] authentication of cell lines would be considered a weakness of the application.” Wissenschaftsverlage verhalten sich dagegen zögerlicher. So schlugen Plass‘ Vorgänger auf dem IJC-Chefredakteurs-Posten bereits vor 15 Jahren anderen Zellbiologie- und Krebsjournalen eine gemeinsame Initiative vor, die Authentifizierung von Zelllinien als obligatorische Qualitätskontrolle einzuführen. Auf Interesse stieß der Vorschlag nur selten – vermutlich aufgrund des Mehraufwands. Die meisten Journale sahen die Verantwortung bei den Forschenden und ihren Gutachtern (PLoS Biol. 15(4): e2001438). Neben dem IJC verlangen heutzutage nur wenige Fachzeitschriften wie Nature- sowie BioMed-Central-Journale Authentifizierungsdokumente.

Entsprechend skeptisch bleibt Plass: „Appelle und guter Glaube daran, dass Autoren ihre Zelllinien authentifizieren, reichen in der Erfahrung des IJC nicht aus. Nur Einschränkungen kurieren die Wissenschaftsgemeinde von der stillen Gefährdung durch Kreuzkontaminationen.” Davon ist auch Drexler überzeugt: „In meiner Erfahrung haben weder Autoren noch Journale jemals eine Publikation zurückgezogen – selbst wenn sie zugaben, dass ihre Zelllinien falsch waren. Ein Retraktionszwang wäre ein geeigneter Ansatzpunkt, eine Änderung in der Forschermentalität einzuläuten.” Begeisterungsstürme lösen diese Vorschläge sicher nicht aus.